Come utilizzare Restore Western Blot Stripping Buffer 21059

Come utilizzare Restore Western Blot Stripping Buffer 21059


Western Blotting è una tecnica biotecnologica per rilevare una proteina specifica in un campione. Esso comporta la separazione delle proteine ​​per dimensione e carica, mediante una procedura chiamata elettroforesi su gel; il conferimento ad una membrana di PVDF o nitrocellulosa; e l'aggiunta di anticorpi primari. Se è presente la proteina di interesse, gli anticorpi si legano ad esso.

Infine, il ricercatore aggiunge anticorpi secondari che si legano agli anticorpi primari. Gli anticorpi secondarty portano un enzima che emette luce in presenza della proteina; la quantità di luce che emettono riflette la quantità di proteina nel campione.

Restore è un marchio di macchia buffer di strippaggio che è possibile utilizzare per rimuovere gli anticorpi primari e secondari, se è necessario ri-sondare il campione.

istruzione

1 Scaldare la bottiglia di ripristino Western Blot Stripping Buffer 21059 fino a quando è a temperatura ambiente. Lasciando la bottiglia per diverse ore, o durante la notte, porterà a temperatura ambiente. Se necessario, è possibile controllare con un termometro.

2 Lavare la macchia con tampone di lavaggio per rimuovere qualsiasi substrato chemiluminescente che rimane dal primo sondaggio. Aggiungere abbastanza Restore Western Blot Stripping Buffer per bagnare completamente la macchia. Il produttore consiglia di 20 millilitri come una quantità appropriata di una macchia 8-by-10-centimetri.

3 Incubare la macchia con il tampone a temperatura ambiente. Se gli anticorpi che hai usato per sondare la macchia era alta affinità, potrebbe essere necessario incubare la macchia alla temperatura leggermente più alta di 37 gradi Celsius (98,6 gradi Fahrenheit) e concedere più tempo. In generale, però, da 5 a 15 minuti dovrebbe essere sufficiente per rimuovere sia primario e anticorpi secondari.

4 Aggiungere il substrato perossidasi chemiluminescente alla macchia, e mettere un foglio di pellicola fotografica sulla membrana. Il film cambierà colore ovunque la luce lo colpisce. Se la pellicola fotografica non ha rilevato alcuna luce emessa dal campione dopo 5 minuti, è stato rimosso l'anticorpo secondario e il suo enzima coniugato.

5 Aggiungere l'anticorpo secondario alla macchia. Lavare la macchia nel tampone di lavaggio e di esporre di nuovo per la pellicola fotografica, proprio come al punto 4.

Se non si vede un cambiamento dopo 5 minuti, è stato rimosso l'anticorpo primario e può ri-sondare la macchia per convalidare i risultati precedenti.

Se non è stato rimosso con successo sia l'anticorpo primario o secondario, ri-incubare la macchia in Rimuovere Western Blot Stripping Buffer, come descritto nei punti 2 e 3. consentire un ulteriore 5 a 15 minuti per garantire la rimozione di entrambi gli anticorpi primari e secondari , e quindi ripetere i passaggi 4 e 5.

Consigli e avvertenze

  • È importante incubare la blot abbastanza lungo per rimuovere tutto l'anticorpo primario e secondario, ma non sufficiente per danneggiare la proteina di interesse. In generale, da 5 a 15 minuti dovrebbe essere sufficiente; a seconda della proteina si sta lavorando, tuttavia, ci possono essere eccezioni.
  • Mai condurre un esperimento di questo tipo senza indossare attrezzature adeguate di sicurezza (ad esempio, occhiali di protezione antispruzzo, guanti, camice da laboratorio) e seguendo i protocolli e le procedure di sicurezza del laboratorio.