Come calcolare Concentrazione dell 'anticorpo

Come calcolare Concentrazione dell 'anticorpo


Uno dei metodi più comuni di calcolare una concentrazione di proteina in un ambiente di laboratorio è usare un Bradford Assay. Il Bradford reagente è un reagente colorimetrico che cambia colore in base a concentrazione proteica. Grazie alla combinazione di una curva standard noto con il reagente di Bradford, è possibile creare un provvedimento contro il quale è possibile calcolare la concentrazione di ogni proteina, tra cui gli anticorpi.

istruzione

Creare uno standard

1 Misurare 200 mg di BSA in peso carta utilizzando una scala di laboratorio. Racchiuderlo in una provetta. Aggiungere 2 ml di tampone per la provetta contenente 200 mg di BSA. Etichettare questo tubo "1."

2 Vortex tubo 1 fino a quando la BSA è completamente sciolto.

3 Rimuovere 500 ul di BSA in tampone e trasferirlo ad un secondo tubo. Etichettare questo tubo "2." Aggiungere 500 ul di tampone pianura al tubo 2.

4 Togliere 200 ul di BSA in tampone dalla fermata 1 e trasferirlo in una nuova provetta. Etichettare questo tubo "3." Aggiungere 800 ul di tampone pianura al tubo 3.

5 Rimuovere 100 ul di BSA in tampone dal tubo 1 e trasferirlo in una nuova provetta. Etichettare questo tubo "4." Aggiungere 900 ul di tampone pianura al tubo 4.

6 Rimuovere 10 ul di BSA in tampone dalla fermata 1 e trasferirlo in una nuova provetta. Etichettare questo tubo "5." Aggiungere 990 ul di tampone pianura al tubo 5. Tubi 1- 5 comprendono una serie standard graduata. Il primo tubo ha una concentrazione nota di 100 mg / ml; il secondo, 50 mg / ml; il terzo, 20 mg / ml, il quarto, 10 mg / ml; e il quinto, 1 mg / ml. Ogni tubo contiene circa 1 ml di soluzione.

Creare Anticorpo diluizioni

7 Aggiungere 5 0ul di anticorpo purificato al 95 0ul di tampone. Etichettare questo tubo "A."

8 Aggiungere 10 ul di anticorpo purificato a 990 ul di tampone. Etichettare questo tubo "B"

9 Aggiungere 2 ul di anticorpo purificato da 998 ul di tampone. Etichettare questo tubo "C."

Caricare la piastra

10 Collocare 0,5 ml di tampone pianura nei primi pozzi in due colonne della piastra pozzetti.

11 Collocare 0,5 ml del contenuto del tubo 1 nel secondo pozzetti delle prime due colonne piastra pozzetti. Continuare lungo la serie graduata fino alle prime due colonne contengono 0,5 ml di una soluzione standard BSA da ciascuno dei tubi 1-5, compresi pozzi per cuscinetto semplice.

12 Aggiungere 0,5 ml di Bradford reagente ad ogni pozzetto. Agitare la piastra per miscelare il reagente con le soluzioni proteiche, facendo attenzione a non versare il contenuto di qualsiasi dei pozzi. Aspetta 5 minuti.

13 Leggere la piastra secondo il protocollo specifico per il vostro lettore di piastre alla lunghezza d'onda di 595 nm.

Calcola Concentrazione Anticorpale

14 Copiare i valori letti dal lettore di piastre in Microsoft Excel.

15 Creare un grafico da due colonne di valori che rappresentano lo standard BSA utilizzando la Creazione guidata Grafico in Microsoft Excel.

16 Tracciare i punti misurati dalle diluizioni di anticorpi nel grafico di Excel. Leggere le corrispondenti concentrazioni di proteine ​​in base al valore di y per il punto diluizione dell'anticorpo sul grafico Excel.

17 A seconda se si sta utilizzando i valori ottenuti dalla fermata della A, B o C, moltiplicare il valore per entrambi i 20, 40 o 500, rispettivamente. Il valore risultante è la concentrazione del vostro anticorpi purificati.

Consigli e avvertenze

  • Usare tamponi di sospensione senza proteine ​​o saranno i risultati imprecisi perché il Bradford reagente reagisce in maniera non specifica con le proteine.