Come preparare i campioni per Western Blot

Western blot è una tecnica utilizzata in biochimica per rilevare i tipi di proteine ​​in un campione. Le proteine ​​vengono separate mediante elettroforesi su gel e trasferite ad una membrana, dove viene sondato con anticorpi. Gli anticorpi attaccano alle proteine ​​sulla membrana. Un prodotto chimico fluorescenti viene quindi aggiunto alla membrana, che reagisce con gli anticorpi tali che le proteine ​​sono visibili dopo l'esposizione al cinema.

istruzione

1 Lavarsi le mani e indossare guanti di lattice o di nitrile.

2 Rimuovere il tessuto cellulare dalla camera di incubazione. Mettere circa 1 grammo di tessuto in un mortaio. Aggiungere abbastanza azoto liquido per la malta per coprire il tessuto. Macinare il tessuto congelato con il pestello finché è una polvere.

3 Aggiungere la polvere in una provetta. Aggiungere 10 ml di tampone di lisi alla provetta. Utilizzare un Polytron in 20 secondi scoppia fino alla polvere e liquido sono omogenei.

4 Tappare la provetta e metterlo in una centrifuga. Eseguire il centrifugare a una forza centrifuga 500 a 4 ° C per 15 minuti. Rimuovere il liquido nella parte superiore del tubo con una pipetta e scarti.

5 Aggiungere 5 ml di tampone di lisi per il pellet in provetta per 20 secondi. Centrifugare il tubo di nuovo per lo stesso tempo e alla stessa temperatura e la forza come nel passaggio 4. Rimuovere il liquido nella parte superiore della provetta. Aggiungere 5 ml di liquido tampone di lisi e ripetere il passaggio centrifuga.

6 Aggiungere tampone di risospensione sufficiente a provetta per coprire il pellet. Agitare la provetta delicatamente per miscelare il pellet e tampone. Versare il liquido in tubi eppendorf e congelare i campioni a 80 gradi Celsius negativi.

Consigli e avvertenze

  • Evitare ripetuti cicli di disgelo-congelamento dei vostri campioni, in quanto può danneggiare le proteine.